» risultati sperimentali

La superficie OsteoNext possiede una morfologia porosa e rugosa, caratterizzata da pori omogenei di dimensione micrometrica. L’ossido di titanio modificato è completamente aderente al titanio sottostante infatti non sono presenti cricche o delaminazioni superficiali o distacchi.


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Superficie al microscopio elettronico a scansione di:
A) Titanio TQ 2000X
B) OsteoNext 1500X


La superficie dell’impianto dentale con trattamento OsteoNext appare omogenea e segue perfettamente la geometria filettata dell’impianto senza compromettere il profilo tagliente della cresta dei filetti. Nessuna evidenza di difetti o delaminazioni dell’ossido superficiale in corrispondenza del tagliente e della gola dei filetti.


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Superficie al microscopio elettronico a scansione di:
A) Impianto trattato OsteoNext 125X
B)Filetto impianto trattato OsteoNext 250X
C) Gola impianto trattato


OsteoNext 500X OsteoNext conferisce estrema idrofilicità alla superficie del titanio grazie all’abbondanza di gruppi OH in superficie, con valori dell’angolo di contatto prossimi allo zero. Questa proprietà implica un ottimo comportamento della superficie a contatto con il sangue ed i tessuti biologici.


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OsteoNext - angolo di contatto statico ≈ 0°

SLA angolo di contatto statico ≈ 85°


La superficie OsteoNext presenta un’importante presenza di calcio e fosforo in superficie, noti elementi essenziali nello sviluppo e nella formazione della fase minerale del tessuto osseo. Il trattamento OsteoNext presenta un alto rapporto calcio/fosforo, tipico di una fase minerale appena depositata (Ca/P > 2.9) che è noto da letteratura stimolare l’attività metabolica cellulare. Questo permette di creare un’intima apposizione di tessuto osseo tra la superficie dell’impianto e il tessuto osseo neoformato.  Oltre a ciò il trattamento OsteoNext è arricchito con silicio che è riconosciuto essere essenziale nel metabolismo del tessuto scheletrico e nella calcificazione della matrice ossea.


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Analisi ICP: Contenuto di calcio e di fosforo presente sulla superficie OsteoNext
confrontata con la superficie biomimetica BioSpark® considerata il riferimento ottimo


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Composizione chimica d superficie effettuata tramite microanalisi EDS su:
A) Trattamento biomimetico BioSpark® evidenza di calcio (rosso) e fosforo (blu) in superficie;
B) OsteoNext rilevante presenza di calcio (rosso), fosforo (blu), silicio  (verde) e sodio (fucsia)

 

Quando posta a contatto con il plasma umano, la superficie OsteoNext coordina un adsorbimento preferenziale di fibronectina rispetto all’albumina. La fibronectina è una proteina che gioca un ruolo chiave nella mineralizzazione coordinando la proliferazione e l’organizzazione delle cellule osteoblatiche ed intervenendo nelle fasi di nucleazione dei cristalli di idrossiapatite della fase minerale dell’osso. OsteoNext scoraggia invece l’adsorbimento di albumina, una proteina “passivante” presente in grande quantità nel plasma umano. Tale proteina opera una “schermatura” della superficie su cui viene adsorbita ostacolando i processi di adesione cellulare.


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Rapporto tra fibronectina e albumina adsorbite in superficie dopo 4h di incubazione in plasma umano


Le caratteristiche chimico-fisiche della superficie biomimetica OsteoNext sono particolarmente utili nel favorire i fenomeni di mineralizzazione: la precipitazione di idrossiapatite in Simulated Body Fluid (SBF) raggiunge sulla superficie OsteoNext ben 12μm di spessore dopo soli 14 giorni di immersione a 37°C [3].


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Immagine in sezione dei campioni: precipitazione di idrossiapatite dopo 14 giorni in SBF su:
A) OsteoNext 12±0.8 μm di spessore di idrossiapatite
B) BioSpark® 5±0.1 μm di spessore di idrossiapatite


L’analisi attraverso rifrattometria dei raggi X conferma che il calcio fosfato depositato in superficie è idrossiapatite nano cristallina tipica della fase minerale dell’osso.


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Spettro ai raggi X dei campioni analizzati dopo immersione per 14 giorni in SBF.
Il calcio fosfato depositato in superficie è idrossiapatite nanocristallina


La superficie OsteoNext rappresenta un’ottima piattaforma per l’adesione e la proliferazione delle cellule osteoblestiche [4,5,11,13] mostrando alti livelli di attività metabolica cellulare e di produzione di osteocalcina. L’osteocalcina è considerata uno dei più importanti marcatori biochimici di neoformazione ossea in quanto viene prodotta dagli osteoblasti durante i processi di rimodellamento osseo e possiede una marcata affinità per l’idrossiapatite.


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A) Attività metabolica cellulare di cellule simil-osteoblastiche MG63 dopo 7 giorni di coltura. La superficie OsteoNext migliora l’attività metabolica cellulare rispetto alla superficie biomimetica di controllo
B) Produzione di osteocalcina da parte delle cellule MG63 coltivate sui differenti campioni per 7 giorni: OsteoNext incrementa la produzione del marcatore biochimico di neoformazione ossea rispetto ai controlli

Le cellule osteoblasti che aderiscono perfettamente alla superficie OsteoNext assumendo una morfologia completamente appiattita con numerosi prolungamenti citoplasmatici utili alla cellula per ancorarsi alla superfici. La particolare morfologia porosa di OsteoNext.


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Cellule osteoblastiche MG63 adese alla superficie OsteoNext dopo 12h di coltura


OsteoNextplus rappresenta una famiglia di trattamenti ideati allo scopo di conferire proprietà antibatteriche alle superfici in titanio potenziandone nello stesso momento le proprietà osteointegrative. OsteoNextplus è stato progettando in maniera tale da inglobare oltre che il calcio, il fosforo ed il silicio anche particolari agenti antibatterici nella superficie del biossido di titanio come sali di gallio o sali d’argento [2]. Durante il trattamento ASD i sali antibatterici vengono complessati con opportuni agenti complessanti in maniera tale da renderli disponibili in soluzione durante il trattamento ASD.

La superficie dei trattamenti OsteoNextplus appare microporosa e nanorugosa, con ossidi ben aderenti privi di delaminazioni o di distacchi. Della famiglia OsteoNextplus il trattamento GaO(che sfrutta come agente antibatterico il sale di gallio con l’acido ossalico) presenta rispetto agli altri trattamenti antibatterici una superficie più irregolare caratterizzata da pori di dimensione inferiore rispetto alle altre superfici.


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Superficie al microscopio elettronico a scansione a 1500X di:
A) OsteoNextplus NPs
B) OsteoNextplus AgC
C)  OsteoNextplus GaC
D) OsteoNextplus GaO


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Composizione chimica superficiale analizzata mediante analisi EDS:
A) OsteoNextplus NPs, superficie con calcio (rosso), fosforo (blu) e silicio (verde) con l’aggiunta di nanoparticelle d’argento (fucsia tratteggio)
B) OsteoNextplus GaC superficie con calcio (rosso), fosforo (blu), silicio (verde)  e nitrato di gallio (complessato con L-cisteina) (fucsia tratteggio)


Le superfici OsteoNextplus possiedono un’alta idrofilicità superficiale se confrontata con quella del titanio non trattato che può raggiungere valori di valori di angolo di contatto inferiori a 20° (NPs). L’idrofilicità superficiale rappresenta una proprietà estremamente importante per la rigenerazione dei tessuti; infatti numerosi studi riportano come superfici idrofiliche possiedono un miglior comportamento biologico sia in vitro che in vivo.


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Bagnabilità delle superfici antibatteriche OsteoNextplus rispetto al titanio non trattato e alla superficie OsteoNext. I valori di angolo di contatto rilevati sulle superfici antibatteriche NPs, AgC e GaC risultano estremamente bassi se confrontato con quelli del titanio non trattato a testimonianza dell’alta idrofilicità di queste superfici innovative


Grazie all’utilizzo di marcatori fluorescenti è stato possibile studiare la forma del citoscheletro delle cellule osteoblastiche Saos2 dopo 72 ore di coltura sulle superfici antibatteriche OsteoNextplus. Si può notare come il citoscheletro cellulare appiaia perfettamente appiattito sulle superfici trattate dove sono evidenti numerosi prolungamenti citoplasmatici utili alle cellule per connettersi stabilmente alla superficie porosa di OsteoNextplus. Le cellule stabiliscono ioltre numerosi contatti focali cellula-cellula a riprova dell’alta citocompatibilità delle superfici OsteoNextplus.


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Immagini in fluorescenza ottenute mediante Falloidina (marcatore fluorescente del citoscheletro cellulare) delle cellule Saos2 coltivate sui differenti campioni.
Le cellule risultano perfettamentente aderenti e distese sulla superficie dei campioni:
A) OsteoNextplus NPs
B) OsteoNextplus AgC
C) OsteoNextplus GaC
D) OsteoNextplus GaO


Sia le cellule osteoblastiche di linea Saos2 che le cellule fibroblastiche 3T3 aderiscono perfettamente alla superficie OsteoNextplus mostrando un’alta proliferazione cellulare già dopo 48 e 72 ore di coltura a contatto con le superfici antibatteriche. La presenza di agente antibatterico non è citotossica per le cellule osteoblastiche e fibroblastiche, anzi sembra avere un’effetto di stimolazione sull’attività proliferativa cellulare.


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Proliferazione di cellule Saos2 dopo 48 e 72 ore di coltura sui trattamenti OsteoNext e OsteoNextplus.
Oltre ad escludere qualsiasi effetto citotossicolo per le cellule osteoblastiche è possibile notare come le superfici antibatteriche promuovano la proliferazione delle cellule osteoblastiche


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Proliferazione di cellule fibroblastiche di linea 3T3 dopo 24 e 48 ore di coltura sui trattamenti OsteoNext e OsteoNextplus.
Non si evidenzia alcun effetto citotossicolo per le cellule fibroblastiche ed inoltre è possibile notare che le superfici OsteoNextplus contenenti gallio come agente antibatterico (GaC e GaO)
mostrano addirittura maggiore vitalità fibroblastica rispetto ad OsteoNext


L’attività antibatterica è stata dimostrata mediante l’utilizzo di ceppi antibatterici gram positivi e gram negativi: S.mutans CCUG35176 (Gram +), S.epidermidis RP62A (Gram +) ed E.coli RB  (Gram-). I test sono stati effettuati valutando sia l’attività antibatterica (capacità di uccidere i batteri) dopo 3ore e 24 ore di incubazione delle superfici OsteoNextplus con le differenti soluzioni batteriche, che l’adesione batterica dei diversi ceppi batterici sulle superfici dopo 3h di incubazione. I risultati hanno dimostrato un’effettiva capacità antibatterica delle superfici che in alcuni casi risulta pari al 30% (solo 30 batteri su 100 restano vitali dopo il contatto con le superfici) rapportati al 100% di vitalità batterica per il titanio non trattato (Ti TQ). Inoltre le particolari caratteristiche chimico-fisiche delle superfici OsteoNextplus scoraggiano l’adesione batterica: sulle superfici testate i diversi ceppi batterici analizzati mostrano scarsa capacità di adesione, con conseguente diminuzione della carica batterica presente. Nonostante i trattamenti OsteoNextplus abbiamo una rugosità superficiale media maggiore rispetto a quella del titanio non trattato (Ra OsteoNextplus = 0.8μm vs RaTiTQ=0.2μm) l’adesione batterica risulta notevolmente ridotta (inferiore al 30% di adesione rispetto al Ti TQ).


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A) Vitalità delle cellule batteriche di S.mutans coltivate a contatto con i campioni per 3 e 24 ore. In tutti i casi i trattamenti OsteoNextplus producono un effetto antibatterico presentando vitalità batterica pari al 30% (GaO dopo 24h) rispetto al titanio non trattato.
B) L’adesione batterica dello S.mutans sulle superfici OsteoNextplus dopo 3h di incubazione nella soluzione batterica è notevolmente decrementata rispetto a quella del titanio liscio non trattato (fino al 30% per GaO e 35% per NPs)


Comportamento analogo si verifica anche per il ceppo S.epidermidis: anche in questo caso l’attività antibatterica e not fouling (antiadesiva) delle superfici OsteoNextplus raggiunge rispettivamente il 30% ed il 40% rispetto al titanio liscio non trattato.


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C) Vitalità delle cellule batteriche di S.epidermidis coltivate a contatto con i campioni per 3 e 24 ore. In tutti i casi i trattamenti OsteoNextplus producono un effetto antibatterico presentando vitalità batterica pari al 30% (GaO dopo 24h) rispetto al titanio non trattato.
D) L’adesione batterica dello S.epidermidis sulle superfici OsteoNextplus dopo 3h di incubazione nella soluzione batterica è notevolmente decrementata rispetto a quella del titanio liscio non trattato (fino al 40% per GaO e 50% per NPs)


Le superfici OsteoNextPlus si dimostrano efficaci anche per  il ceppo Gram negativo testato: E.coli. In questo caso l’efficacia antibatterica delle superfici innovative OsteoNextplus raggiunge il 60% e ben il 50% di E.coli non riesce ad aderire alle superfici trattate, a differenza di quelle in titanio liscio dove aderisce la totalità dei batteri.


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E) Vitalità delle cellule batteriche di E.coli coltivate a contatto con i campioni per 3 e 24 ore. In tutti i casi i trattamenti OsteoNextplus producono un effetto antibatterico presentando vitalità batterica pari al 60% (GaO dopo 3 e 24h) rispetto al titanio non trattato.
F) L’adesione batterica dello E.coli sulle superfici OsteoNextplus dopo 3h di incubazione nella soluzione batterica è notevolmente decrementata rispetto a quella del titanio liscio non trattato (fino al 60% per GaO e per NPs)